海洋微生物调查技术要求和调查要素

海洋微生物调查技术要求和调查要素

技术要求

采样站位和层次

a)站位布设应尽量和其他调查项目一致;

b) 采样水层见表1,但可去除5 m水层;大洋调查可增加500 m.1 000 m.2 000 m.....等水层的采样;

c) 海洋沉积物中微生物取样层次,大面调查取表层;断面调查时,将岩芯管以3cm间隔分层;对于特殊调查项目,可根据实际需要确定采样层次。

无菌操作

a) 采水器上的采样瓶、袋应预先灭菌;

b) 实验室内水.泥样分样和分离培养鉴定过程中,均按无菌操作要求进行;

c) 其他凡属海上调查所需物品，如水样贮存瓶(棕色)、移液管(1 cm*、5 cm*、10 cm')、培养皿等均需洗净,包封灭菌、足量备用。

样品保存

样品应在采样后2 h内处理、分析。若暂放冰箱保存，不得超过24 h。

调查要素

海洋微生物调查要素为:海洋微生物现存量,即病毒、细菌总数与微生物其他类群(放线菌、酵母、霉.菌等)的丰度和海洋微生物的活性，即细菌生产力、微生物异养活性、生态呼吸率的测定。

采样

主要仪器设备

采水器

根据采样深度,选用尼斯金采水器或击开式采水器。

采泥器

箱式采样器、多管采样器或弹簧采泥器,见小型底栖生物调查的采样器。

采水样

a)按实际情况选用采水器;

b) 采水器开启后,应停留片刻,待水样装满;

c) 按测定项目计算采水量,若同一水层分几次采样,样品应混匀,再按各测定项目要求分装、处理。

采泥样

用无菌工具从预定层次中取10 g~20 g样品,置于无菌容器。

样品分析

主要仪器设备

荧光显微镜

具备蓝光道和紫外光道供观察吖啶橙和DAPI染色,配置照相机或高分辨率并适用于弱光场的数码相机。

液体闪烁计数仪

具有测定"C和H的功能。

恒温培养箱

具有测定"C和"H的功能。

恒温培养箱

控温范围:5C~50C。

抽滤装置

进口成品滤器组或自行装配25mm和47mm滤器和负压抽滤设备。放射性同位素示踪测试的抽滤设备必须专用,不能与微生物计数混用。

移液枪

置备不同功用的移液枪。

微生物自动鉴定仪

现有的微生物鉴定仪器主要应用于医学微生物鉴定,有条件的单位选用较适用于环境微生物鉴定的仪器产品。

消耗性材料

滤膜

a) 微孔滤膜(材料:醋酸纤维或硝化纤维):直径25 mm和47 mm,孔径0.2 μm、0.45 μm和0.8 μm;

b) 黑色核孔滤膜(材料:聚碳酸酯):直径25 mm,孔径0.2 μm;

c) 氧化铝滤膜:直径25 mm,孔径0. 02 μm。

注射器和滤器

一次性无菌注射器和0.2μm无菌滤器。

荧光显微镜计数用的装样瓶

a)50cm3螺盖聚丙烯瓶:用前用5%HCl溶液浸泡1d以上,并经0.02μm滤膜过滤的蒸馏水漱洗并高压灭菌;

b)50cm3螺盖塑料瓶:用前用5%HCl溶液浸泡1d以上,并经0.2um滤膜过滤的蒸馏水漱洗并高压灭菌。

同位素示踪培养瓶和闪烁计数瓶

a) 50 cm3螺盖培养管;

b)125cm3螺盖培养瓶;

c)20cm3或7cm’与闪烁仪匹配的玻璃或塑料闪烁瓶。

玻璃器皿

培养皿、BOD培养瓶和常用玻璃器皿。

培养基、试剂和工作溶液

培养计数用的培养基、试剂

陈海水

取天然海水避光保存3个月以上,使用时取其清液或经0.45μm滤膜过滤的滤液。

表面活性剂.

将吐温- 80(Tween-80)按体积分数为1 : 2 000比例配成水溶液(工作液)高压灭菌备用。

样品处理

水样处理

外荧光直接计数的水样

a) 病毒计数:取水样50 cm2于预先处理的采样瓶中,加甲醛溶液2.5 cm2(甲醛在样品中的质量浓度为2%)固定样品,样品应立即分析,否则应在4C避光保存,但只能保存一周。

b) 细菌计数:取水样50 cm2于预先处理的采样瓶中,加甲醛溶液2.5 cm2* (甲醛在样品中的质量浓度为2%)固定样品,样品于2C~8C低温保存。滤膜萌发、平板计数的水样按10cm3/dm'量加灭菌的吐温一80工作溶液。

细菌生产力水样

a)[甲基-3H]胸腺嘧啶核苷示踪水样取3支50 cm2带螺盖培养管,各加入20 cm2水样,其中- -管加1 cm°甲醛混匀为对照,再向各管加人[甲基~H]胸腺嘧啶核苷工作溶液，使其终浓度为250 nmol/dm°(即加入1 cm3 该示踪剂的工作溶液),混匀,置现场温度培养1 h,再加人1 cm2甲醛于测样瓶中摇均,以终止培养并保存于冰箱。对活性较低的水体,应适当延长培养时间。

b) [2 H]亮氨酸示踪水样用[4,5-3 H]亮氨酸代替[甲基-3 H]胸腺嘧啶核苷,使其在样品中的最终浓度为20 nmol/dm2 (即加20 mm示踪剂于20 cm样品中),其余步骤同上。

微生物异养活性测定的水样

取3个125 cm3带螺盖三角瓶,各加入100cm3水样,其中1瓶加入5cm2甲醛溶液作对照,再向各瓶加入D-[UL-"C]葡萄糖工作溶液1 cm3 ,盖紧混匀，置现场水温暗培养1 h后,加入5 cm3甲醛于测样中,摇匀以终止培养。

生态呼吸率测定水样

将水样按溶解氧测定要求注入4个250 cm2* BOD培养瓶中,其中2瓶立即固定,另2瓶置暗处于现场水温条件下培养1d后,取出固定。对寡营养水体的样品应适当延长培养时间。

泥样处理

微生物计数泥样取约2 g泥样,精确称重后,置于装有含吐温一80(10 cm*/dm3)的18 cm3海水并加玻璃珠的无菌三角瓶中,充分播荡,制成悬浮液。

测定干重泥样

保存余下的泥样供测干重。

记录

将以上结果分别记录于表。

样品分析

水样微生物计数

微生物计数包括针对总菌数的“直接计数”和针对可培养微生物的“培养计数”。“直接计数”采用落射荧光显微镜,有条件的应采用流式细胞仪。

荧光显微镜直接计数

SYBR Green I直接计数法

适用于测定病毒总数。也可同时测定细菌总数,但在病毒颗粒最佳分布的视野中,细菌数偏少,且制片操作步骤繁琐、氧化铝滤膜价格目前是核孔滤膜的4倍。其工作程序如下:

a)滤器装配:长期未用的滤器应先装好滤器和抽滤装置,用经0.02μm过滤的高压灭菌蒸馏水加满滤简并抽滤清洗2次或3次,(当天使用的滤器,在各个样品测定前用同样方法清洗一次，清洗时不必取下衬垫滤膜),再卸下滤筒在滤板上先放置孔径为0. 45 pμm或0.8 μm的25 mm微孔滤膜作衬底(衬底可多次使用);然后将孔径为0.02 μm氧化铝滤膜放于衬垫上,再装配.好滤筒;

b)配制染色剂:临用前,取出SYBRGreenI储备液(6.3.2.2.2a)),用经0.02μm过滤的无菌去离子水按1:10稀释(如加5mm'储备液到45mm’稀释水中),操作必须在弱光环境中进行，未用完的储备液应立即放回一20C冰箱避光保存;

c) 配制荧光保护剂工作液:临用前取10% p-苯二胺储备液(6.3.2.2.2 b))、化霜、播匀后,吸取10 mm3与990 mm'PBS甘油储备液(6.3.2.2.2 b))混合,制成工作液,该工作液应避光、置冰浴,未用完的10% p-苯二胺储备液应立即再行冷冻,但该储备液管累计冻、融3次后,便须丢弃;如果p-苯二胺储备液或荧光保护剂工作液呈棕色,弃之不用并重新配制;

d) 加样:加入适量样品(1 cm'~10 cm3，即视野病毒数控制在50个左右),若样品量少于1 cm3则应先加入2 cm°经0. 02 μm过滤的无菌海水,再加样,以便病毒、细菌均匀分布于滤膜上;

e) 抽滤:在负压(15 kPa~20 kPa)条件下,把样品抽滤至干,卸下滤筒;

f) 染色:吸取97.5 mm3经0.02 μm过滤的无菌去离子水,滴人干净的无菌塑料培养皿,再向该水滴加入2.5 μL 10% SYBR Green I染色剂工作液(此时,染色剂浓度为0. 25%),培养皿及染色剂需置于冰浴、避光处;用扁平头镊子在负压状态下,取下载有样品的氧化铝滤膜,将膜的背面(非载样面)放在培养皿的染色液滴上冰浴、避光染色15min;

g) 制片:染色后,取出滤膜,吸干贴上滤膜背面及边缘的液滴,把滤膜紧贴于载玻片上(载样面朝上),并在盖玻片上加30 mm°荧光保护剂工作液,具液面朝下盖紧滤膜(滤膜上下两面均不能有气泡),用指甲油密封盖玻片四周,制片在一20C条件下可保存2周~3周,但以立即计数为宜;

h)计数:在荧光显微镜蓝色激发光道、油镜条件下，病毒颗粒呈针扎(pinprick)状、亮绿色,细菌细胞亦呈亮绿色,但其亮度强于病毒颗粒,且菌体比病毒颗粒大得多。随机取10个~20个视野,计算病毒颗粒数(如果要同时计算细菌数的话,还需计算具有细菌形态的细胞数),每个样品至少计数200个病毒(或细菌);

i) 每次(不同测定日期)测定时,应加测不加样品的空白对照,对于空白制片,每个视野不得出现1个以上病毒(或细菌)。

j)计算样品含病毒颗粒数

吖啶橙直接计数法

适用于测定细菌总数，工作程序如下:

a)滤器装配:长期未用的滤器应先装好滤器和抽滤装置,用经0.2μm过滤的高压灭菌蒸馏水加满滤简并抽滤清洗2次或3次,(当天使用的滤器,在各个样品测定前用同样方法清洗-一次,清洗时不必取下衬垫滤膜),再卸下滤简在滤板上先放置孔径为0.8μm或0.45 μm的25 mm微孔滤膜作衬底(衬底可多次使用);然后将黑色核孔滤膜(光滑面朝上)放于衬垫上,再装配好滤筒;

b) 加样:加人适量样品(控制在视野出现菌体50个左右),若样品量少于1 cm’则应先加人2 cm3经0.2 μm过滤的无菌海水,再加样,以便细菌均匀分布于滤膜上;

c)抽滤:在负压(50kPa)条件下,把样品抽滤至滤膜刚好呈湿润状态,并释放真空;

d) 染色:用无菌注射器吸取吖啶橙工作液,套上0.2 pμm无菌滤器,沿滤筒壁加入约1 cm3染色液，使其盖满滤膜并染色5 min~10 min。而后在同样负压下抽滤至干;

e) 制片:在载玻片上加一小滴无荧光镜油,贴上滤膜(载菌一面朝上),并在盖玻片上加一小滴同样镜油,具油面朝下盖紧滤膜(滤膜上下两面均不能有气泡),用指甲油密封盖玻片四周,制片在一20C条件下可保存数月,但以立即计数为宜;

f)计数:在荧光显微镜蓝光道,油镜条件下,随机取10个视野,计算具有细菌形态呈亮绿色的细胞数;每个样品至少计数300个菌体;每次(不同测定日期)测定时,应加测不加样品的空白对照,空白制片,每个视野不得出现1个以上细菌;

 DAPI直接计数法

适用于测定细菌总数,和吖啶橙染色法相比,背景更清晰,荧光色素干扰较少,菌体着色不易衰减但需要用紫外光激发滤光系统(即:G 365激发滤光片,FT 395分射滤光片,LP 420吸收滤光片)的显微镜观察。其工作程序除了用DAPI工作溶液(即:10 ug/cm2)代替吖啶橙染色液外,其余步骤均相同。当本计数法与吖啶直接计数法的计数结果有异议时,以本计数法为仲裁计数法。

细菌体积测定一显微摄影、幻灯测量法

细菌生物量(以C计)与细菌个体大小相关。通过测定细菌体积并借助于经验转换系数,把细菌转化为细菌生物量。已有许多方法应用于测量细菌体积,数码摄像并带影像自动分析软件系统属较先进的技术,需要大资金的设备投入,而显微摄影- -一幻灯测量法系普 及型技术,具体工作程序如下:

a) 胶卷安装和系统测试:选用ASA 400彩色反转片胶卷,按显微摄影要求操作,并通过测试比较,选择适当的曝光组合;

b) 样品拍照:在荧光计数时,选择5个~10个菌数较多的视野,进行拍照，以便在照片上获得足够多的菌体。同时记录照片序号和相对应的样品号;

c)标尺拍照:在与细菌直接计数相同放大倍数条件下,利用显微镜普通光系统,清晰地拍照台围尺标度;

d) 制备幻灯投影:冲洗拍照的胶卷, 制成幻灯片,装人幻灯机,投影于贴白纸的墙壁上;

e) 菌体测量:用游标卡尺测量幻灯投影台微尺的长度,注意测量不同部位的长度,以便获得统计平均值。选择轮廓清晰的菌体,测量其长度和宽度,并作记录。每测完一个菌体,应立即作标记,以防重复测量;

f)细菌体积计算:先根据台微尺刻度实际长度和幻灯投影上测量长度的放大比例,计算出被测细菌实际长度和宽度,然后按下述公式,计算细菌体积;

培养计数法

滤膜萌发计数法

适用于测定微生物活菌数,多用于水深大于200 m的海区。工作程序如下:

a) 滤膜处理:使用前, 微孔滤膜(孔径0.2 pm,直径47 mm)用铝箔纸包好,高压灭菌;

b) 滤器装配:不用加衬垫;

c) 加样:加适量样品(以每片滤膜出现30个~50个左右的菌落为宜),若加样量少,应添加适量高压灭菌海水稀释;用于放线菌.酵母.霉菌计数的样品，加样量应略大;每个样品一般取两种过滤量，每种过滤量重复三片滤膜;

d) 抽滤:;

e) 培养:将滤膜粗糙面(即:没有载滤物的一面)紧贴于备好的平板培养基上(滤膜和培养基间不得有气泡),将平板倒置于接近样品现场温度的恒温箱培养4d~15d;

f)计数:在放大镜下或用菌落计数器,按菌落形态，分别计算各种培养基中四大菌类的菌落数(必要时,用显微镜观察确证);

g)计算样品含菌数

微生物分类鉴定

条件许可时应进行微生物分类鉴定。

菌种分离、纯化和保存

用接种针从微生物培养计数的平板或滤膜上挑取全部菌落或部分区域的所有菌落,挑取时注意选择形态特征不同的菌落,挑取的菌落在新平板上反复划线分离,培养数天,选取新形成的单菌落,直至纯种,再接于斜面培养,长成后置冰箱保存待鉴定;如果不是纯种,应继续纯化。

种类鉴定

种类鉴定方法包括传统鉴定法、仪器自动鉴定法和分子生物学鉴定法。

菌种保藏

对一些有代表性或有保存价值的菌种,按菌种保藏法的要求，登记入库,长期保存。

资料整理

利用计算机保存分析、计算数据、制作报表、绘制分布图。

填写报表

按本部分的有关规定填写。

分别将病毒、细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的数量(包括细菌生物量)以及细菌生产力和细菌异养活性的测定结果。

绘制分布图

断面分布图

一般以等值线表示,取值标准视具体情况而定。

a)微生物数量和细菌生物量断面分布图;

b)细菌生产力断面分布图;

c)微生物异养活性断面分布图;

d)生态呼吸率断面分布图。

大面分布图

一般以等值线表示,取值标准视具体情况而定。

a)微生物数量和细菌生物量大面分布图;

b)细菌生产 力大面分布图;

c)微生物异养活性大面分布图;

d)生态呼吸率大面分布图。